Pengendapan Protein

Pretain adalah suatu ikatan polipeptida yang terdiri atas lebih dari seratus asam amino (Poedjadi 1994). Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel (Lehninger 1982). Ciri utama molekul protein yaitu, memiliki berat molekul yang besar; terdiri atas 20 macam asam amino; terdapat ikatan kimia lain yang menyebabkan terbentuknya lengkungan-lengkungan rantai polipeptida menjadi struktur tiga dimensi protein. Struktur lebih tinggi dari protein adalah struktur primer, struktur sekunder, struktur tersier, struktur kuartener. Rentetan asam amino dalam suatu molekul protein disebut struktur primer protein. Bentuk (seperti bentuk spiral) yang padanya suatu molekul protein menata kerangkanya, disebut struktur sekunder. Antaraksi lebih lanjut seperti terlipatnya kerangka untuk membentuk suatu bulatan, disebut struktur tersier. Antaraksi antar sub-unit protein tertentu, seperti antar globin-globin dalam haemoglobin, disebut struktur kuartener (Fessenden 1986).

Protein merurut tugas yang dilaksanakan dibagi menjadi tiga klasifikasi, yaitu serat atau structural, globural, dan konjugasi. Protein serat yang membentuk kulit, otot, dinding pembuluh darah, dan rambut terdiri dari molekul panjang mirip benang yang kiat dan tak lurus. Tipe fungsional lain merupakan protein globural, yang membentuk agak bulat karena rantai-rantai melipat bertumpuk. Protein konjugasi yang dihubungkan ke suatu bagian nonprotein seperti misalnya gula,melakukan pelbagai fungsi dalam seluruh tubuh (Fessenden 1986).

Preotein dapat mengalami denaturasi, menurut Fessenden (1986) denaturasi adalah hilangnya sifat-sifat struktur lebih tinggi oleh kekacauan ikatan hydrogen dan gaya sekunder lain yang mengutuhkan molekul itu. Fator yang menyebabkan denaturasi suatu protein ialah perubahan temperatur, pH, detergen, radiasi, zat pengoksodasi atau pereduksi (yang dapat mengubah hubungan (s-s)., dan perubahan tipe pelarut.

Albumin adalah globuler dengan berat molekul 69000. Albumin diseintesis dihati dan dikatabolisme oleh semua metabolism. Fraksi isoelektrik dari albumin manusia sehat biasanya pI 4.7, 5.1, 5.5 (Gaevskaia VA 1978). Istilah pI ini adalah pH asam amino ketika titik isolistrik, dapat ditentukan dengan titrasi, dengan menentukan terlebih dahulu pK1 dan pK2 dari kurva yang diperoleh dan nilai pI adalah rataan dari pK1 dan pK2.

Pengendapan Oleh Logam

Uji Pengendapan oleh logam. Sebanyak 3 mL albumin dalam tabung reaksi ditambah lima tetes larutan HgCl2 2%. Warna dan endapan pada larutan diamati. Percobaan diulangi, HgCl2 2% digantikan dengan larutan Pb-asetat 5% dan AgNO3 2%.

Pengendapan dengan logam adalah pembentukan senyawa tak larut antara protein dan logam berat. Penambahan Logam pada protein akan mengakibatkan putusnya jembatan garam karena ikatan yang amat kuat, kemudian terjadi denaturasindan secara bersamaan gugus –COOH, NH2, dan gugus R- tertentu akan berikatan dengan logam membentuk senyawa kelat. Logam yang dapat mengakibatkan denaturasi protein adalah Ag, Ca, Zn, Hg, Fe, Cu, Co, Mn, dan Pb. Praktikum ini menguji albumin dengan tiga larutan logam yang berbeda yaitu AgNO3, HgCl2, dan Pb-asetat. Albumin yang telah di tambahkan logam-logam ini mengalapi perubahan dari larutan yang bening menjdi putih keruh, bahkan pada penambahan Pb-asetat membentuk endapan putih yang paling banyak. Pengendapan ini terjadi karena adanya senyawa baru yang terbentuk karena ikatan protein dengan logam dan senyawa tersebut tidak larut dalam air. Kecepatan reaksi yang diamati pada praktikum ini adalah AgNo3, Pb-asetat, dan HgCL2. Seharusnya HgCl2 lebih cepat reaksinya dari pada Pb-asetat karena tetapan disosiasi HgCl2 lebih besar daripada Pb-asetat. Praktikum ini menunjukkan hal yang tidak sesuai, ini dapat disebabkan konsentrasi Pb-asetat dan HgCl2 yang digunakan tidak sama, konsentrasi Pb-asetat 5% sedangkan HgCl2 2%. Pb-asetat lebih besar konsentrasinya maka pastilah, ion Pb2+ yang terbentuk lebih banyak pula, sehingga lebih cepat dan endapan yang diperoleh juga banyak.

Pengendapan Oleh Garam

Uji Pengendapan oleh Garam. Sebanyak 10 mL larutan protein dijenuhkan dengan (NH4)2SO4 dengan cara ditambahkan sedikit demi sedikit hingga titik jenuhnya. Larutan disaring. Kelarutan dalam air diuji. Larutan diuji dengan pereaksi millon dan filtrate diuji dengan pereaksi biuret.

Pengendapan dengan garam adalah pembentukan senyawa tak larut antara protein dan ammonium sulfat. Pengendapan albumin dapat terjadi karena ammonium sulfat melarut dalam air dan mendesak albumin untuk keluar sehingga terbentuklah albumin terendap ketika larutan jenuh dengan ammonium sulfat. Hal ini diistilahkan salting out. Salting out adalah proses penambahan larutan elektrolit kedalam fare air yang mengandung senyawa organik, penambahan elektrolit ini difungsikan agar kelarutan senyawa organik ini bisa menurun, karena garam lebih polar dibandingkan albumin maka air lebih cenderung mengikat garam. Setelah penjenuhan dengan garam diuji kelarutan denga air, hasilnya tidak larut. Uji millon pada endapan tidak menghasilkan warna merah, ini artinya negatif mengandung tirosin. Prinsif reagen millon itu sendiri bembentukan garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai molekul fenol pada gugus R-nya, yang akan membentuk garam merkuri dengan pereaksi millon. Seharusnya uji ini positif karena albumin mengandung tirosin sebagai salah saut asam amino pembentuknya. Filtrat diuji biuret, hasilnya negatif, ini artinya dalam filtrate sudah tidak adalagi ikatan peptide atau dengan katalain tidak ada lagi albumin yang terlarut dalam air. Seluruh albumin sudah digantikan dengan garam.

Koagulasi

Uji Koagulasi. Sebanyak dua tetes asam asetat 1M ditambahkan kedalam 5 mL larutan protein. Tabung diletakkan dalam air mendidih selama 5 menit. Endapan yang terbentuk diambil, selanjutnya diuji kelarutannya dalam air dan diuji dengan pereaksi millon.

Uji koagulasi adalah perubahan bentuk yang ireversibel dari protein akibat dari pengaruh pemanasan. Panas dan pH mengakibatkan denaturasi pada albumin. Oleh sebab itu penambahan asam asetat dan pemanasan menghasilkan endapan albumin, dan endapat tersebut ireversibel (tidak dapat kembali ke keadaan awal. Endapan diuji kelarutan dan hasilnya terlihat larut sebagian, memang endapan tidak dapat kembali dan seharusnya tidak melarut karena endapan yang diperoleh ireversibel, mungkin ada yang lain selain albumin yang ikut mengendap dan larut. Uji millon pada endapan tidak menghasilkan warna merah, ini artinya negatif mengandung tirosin. Prinsif reagen millon itu sendiri bembentukan garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai molekul fenol pada gugus R-nya, yang akan membentuk garam merkuri dengan pereaksi millon. Seharusnya uji ini positif karena albumin mengandung tirosin sebagai salah saut asam amino pembentuknya. Filtrat diuji biuret, hasilnya negatif, ini artinya dalam filtrat sudah tidak ada lagi ikatan peptida atau dengan kata lain tidak ada lagi albumin yang terlarut dalam air. Seluruh albumin sudah terdenaturasi.

Pengendapan Oleh Alkohol

Uji Pengendapan oleh Alkohol. Sebanyak tiga tabung reaksi disediakan dan diberi label 1,2, dan 3. Setiap tabung ditambah 5 mL larutan albumin, dan 6 mL etanol 95%. Tabung 1 ditambah 1 mL HCl 0,1 M, tabung 2 ditambah 1 mL NaOH 0,1 M, dan tabung 3 ditambah 1 mL buffer asetat pH 4,7. Setiap tabung diamati warna dan endapan yang terbentuk.

Pengendapan dengan alkohol adalah pembentukan senyawa tak larut antara protein dan alkohol. Alkohol akan menurunkan konstanta dielektrik sehingga pada saat tertentu akan terbentuk endapan. Larutan albumin dan alkohol ditambah dengan HCl, NaOH, atau buffer asetat pH 4,7, hasilnya endapan terbentuk paling banyak ada di larutan dengan penambahan HCl, dan larutan NaOH. Secara teoritis penambahan buffer yang menyebabkan paling banyak endapan, karena pH 4,7 merupakan pH isoelektrik sehingga endapan yang terbentuk merupakan endapan maksimal yang dapat diperoleh. Namun ini dapat disebabkan pH awal albumin yang memengaruhi buffer sehingga pHsedikit berubah. Dan pH HCl lebih mendekati titik isolistrik sehingga endapannya banyak, dan NaOH benar sedikit endapan karena semakin menjauhkan pH larutan dari titik isolistriknya.

Denaturasi

Uji Denaturasi Protein. Sebanyak 3 tabung reaksi diberi label 1,2,dan 3. Setiap tabung ditambahkan 9 mL larutan albumin. Tabung 1 ditambah 1mL buffer 0,1 M, tabung 2 ditambah 1 mL NaOH 0,1 M, dan tabung 3 ditambah 1 mL buffer asetat pH 4,7. Setiap tabung diamati perubahan larutannya.

Denaturasi adalah hilangnya sifat-sifat struktur lebih tinggi oleh kekacauan ikatan hydrogen dan gaya sekunder lain yang mengutuhkan molekul itu (Fessenden 1986). Uji denaturasi praktikum ini adalh dengan menambahakan buffer asetat pH 4,7, HCl, dan NaOH, masing-masing ke tabung berisi albumin dan diamati. Hasilnya, endapan terbanyak ada pada saat penambahan HCl, karena dibaah pH isolistrik dan NaOH tidak membentuk endapan karena jauh dari pH isolistriknya. Dan saat penambahan buffer, larutan homogeny karena merupakan pH isolistrik.


Daftar Pustaka
Gaevskaia VA. 1978. Isoelectric fractions of healthy human serum albumin and their ability to bind bilirubin. Ukrainskiĭ biokhimicheskiĭ zhurnal. Rusia. Vol 50(6):735-8.
Lehninger. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Penerjemah: Maggy Thenawijaya. Jakarta: Erlangga
Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasat Biokimia. Jakarta : UIP
Fessenden . 1986. Kimia Organik Edisi Tiga. Pudjaatmaka, AH penerjemah dari buku asli Organic Chemistry Third Edition. Jakarta : Penerbit Erlangga